作者：张晓明，陈孙裕，肖德明，徐忠世，代成甫
【关键词】 骨质疏松性骨折;,骨保护素表达;骨折愈合;,成骨细胞
摘要：目的 观察骨质疏松性骨折愈合不同阶段中骨保护素（OPG）的表达，探讨OPG在该过程中的作用。方法 8月龄雌性大鼠40只，随机分为卵巢切除组和假切组,相同条件喂养3个月后造骨折模型，分别于术后第10d、第20d、第30d、第40d取骨痂，通过RTPCR及ELISA检测骨质疏松性骨折及正常骨折愈合过程中骨痂OPG表达。结果 OPG在骨质疏松性骨折愈合过程表达较其在正常组表达明显减弱(P<0.05)。结论 OPG是影响骨质疏松性骨折愈合的关键因子。
关键词：骨质疏松性骨折; 骨保护素表达;骨折愈合; 成骨细胞
The Expression of Osteoprotegerin in the Healing Process of Osteoporotic Fracture
ZHANG Xiaoming,CHEN Sunyu,XIAO Deming,et al
(Shenzhen People’s Hospital,Shenzhen Guangdong 518020 ,China)
ABSTRACT:Objective To investigate the expression and function of osteoprotegerin(OPG) in the healing process of osteoporotic fracture. Methods Eight months old SD rats were randomly divided into ovariectomized group (Ovx) and sham operation group (Sham). After 3 months fed in the same way, all animals were maked fracturing. Using RTPCR and ELISA to detect OPG and to compare data between two groups at different time. Results The expression of OPG in the healing process of osteoporotic fracture is weak. Compared with the Sham group,the expression level of OPG in Ovx group was significantly reduced (P<0.05).Conclusion The OPG is an critical cytokine for the healing of osteoprotic fracture.
KEY WORDS：Osteoporotic fracture; OPG expression;The healing of the fracture;Osteoblast
成骨细胞和破骨细胞活性的协调决定了骨吸收和骨形成之间的平衡, 在促骨折愈合过程中,由骨形成起主导作用。骨保护素（OPG）属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员,是一种分泌型蛋白，有单体和同源二聚体两种形式,单体存在于成骨细胞,二聚体可分泌入骨基质。本实验通过建立大鼠股骨骨质疏松性骨折愈合模型，进一步探讨OPG表达在骨质疏松性骨折愈合机制中的作用。
1 材料和方法
1.1 模型的建立本研究为成组设计的动物试验。SPF级雌性大鼠40 只,8月龄,体重270～320g (购于南方医科大学实验动物中心）。将大鼠随机分为卵巢切除组(Ovx)及假手术对照组(Ｓｈａｍ),各组又以骨折后10、20、30及40d分为4组,每组均5只。①Ovx :以10%的水合氯醛腹腔麻醉,经双侧背部切口开腹，切除双侧卵巢并结扎。② Sham:同样方法麻醉大鼠后,打开腹腔,仅切除少量腹部脂肪。实验期间所有大鼠在同样条件下喂养3个月,自由摄食和饮水。术后3个月右后肢外侧入路造右股骨骨折模型，并用2mm齿科钢丝行股骨髓腔内固定术。分别于第10、20、30及40d无菌条件下取材［2］。标本直接放入液氮冷冻保存,用于总RNA及蛋白提取。取材范围包括两骨折断端0.5cm及其间组织。
1.2 OPGmRNA的提取组织块质量(100mg)液氮研磨后，加Trizol reagent 1ml (invitrogen公司)抽提总RNA。紫外分光光度计测定RNA含量及OD值。标本OD值在1.8～2.1之间，且总RNA经1%琼脂糖电泳，其条带在紫外灯下观察为3条带,分别为18S、28S、5S,且各条带清晰拖尾轻，说明提取RNA质量较好。
1.3 反转录聚合酶链反应法（RTPCR）测定OPGmRNA 采用Takara AMV3.0 RTPCR Kit逆转录后PCR反应检测OPGmRNA。同时扩增β actin作为内参照。引物由上海生物工程研究所合成。OPG引物序列如下:OPG上游引物5'TCCTGGCACCTACCTAAAACAGCA 3'，下游引物5'CTACACTCTCTGCATTCACTTTGG 3';β actin上游引物5'CTTCTACAATGAGCTGCGTG 3'，下游引物 5'TCATGAGGTAGTCAGTCAGG 3' 反应体系共50μl,按下列组成配制PCR反应液:5×PCR Buffer10μl、灭菌蒸馏水28.75μl、TaKaRa ExTaqTMHS0.25μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl共40μl,加入到逆转录反应结束后的PCR反应管中,轻轻混匀。采用热启动PCR进行扩增反应。反应条件:OPG 94℃变性2min、1个循环。94℃变性30s、55℃退火45s、72℃延伸1min,30个循环。PCR产物鉴定和分析：取PCR扩增产物10μl和6×加样缓冲液2μl点样于1.5%琼脂糖凝胶,80V电压下电泳1h,于紫外线箱中观察并照相记录，以DNAmarker(上海生物工程研究所)为标准。通过AlphaImager2200型凝胶成像分析仪对目的基因和参照基因条带进行像素值测定,并算出二者比值。
1.4 ELISA检测ＯＰＧ取骨折端组织100mg液氮研磨后，细胞裂解液提取蛋白［3］。采用R&D systems公司的OPG ELISA Kit(产品编号MOPOO)检测OPG蛋白表达,按照说明书上的步骤进行操作，每孔加入100μl用样品稀释液稀释的蛋白液，其中一孔仅加稀释液，与标准品对照。封膜后室温放置2h，吸去孔内液体，加100μl生物素标记OPG抗体，室温反应2h，洗涤液洗涤3次，每次2min。加入亲和素过氧化物酶复合物，混匀，室温1h。再吸去孔内液体，洗涤5遍，加入反应底物四甲基联苯胺，室温避光反应30min,终止液终止后，应用酶标仪在450nm（校正波长为540 mm）下读数。
1.5 统计学处理。统计分析应用SPSS12.0统计软件,所有数据以 ±s表示,组间差异性比较作单因素方差分析,P<0.05及P<0.01表示差异有显著性或非常显著性意义。
2 结果
RTPCR半定量OPGmRNA：Ovx组OPGmRNA校正后灰度值高于Sham组，在不同时间点表达具有差异性（P<0.05）。Sham组OPGmRNA呈弱阳性表达，部分表达呈阴性，且各时间点灰度值无显著性意义（P＞0.05）。（表1）表1 2组不同时间点OPGmRNA表达的比较(略)
3 讨论
正常骨折愈合过程中，在局部血液供应与生理应力因素共同作用下，骨祖细胞可再活化，由静止转变为活跃，并通过细胞分裂转变为成骨细胞。成骨细胞功能活跃，合成并分泌骨的有机基质，并参与类骨质矿化；破骨细胞数量较少，处于相对静止状态，骨形成大于骨吸收。骨质疏松性骨折是骨质量减少，骨脆性增加所致的病理性骨折，骨代谢失衡贯穿于其发生、发展及愈合过程。骨质疏松性骨折愈合过程中，成骨细胞数量减少，成骨能力降低，破骨细胞数量增加，骨吸收能力增强，骨折愈合能力差。OPG作为 RANKL的可溶性诱骗受体,与RANK竞争RANKL,抑制破骨细胞成熟和活化。OPG/RANK/RANKL系统是破骨细胞分化及发挥功能的重要信号途径,该系统的紊乱将直接导致骨代谢平衡受破坏［4，5］。OPG过多表达会导致严重的骨质硬化，OPG表达缺陷鼠表现严重的骨质疏松及高的骨折发生率［6］ ，用OPG治疗溶骨性疾病发现， OPG能够抑制破骨细胞形成，增加骨密度［7］。本实验通过对骨质疏松性骨折愈合过程骨痂OPG的研究， 结果显示OPG在骨质疏松性骨折愈合中表达较正常减弱，表明OPG在骨折愈合过程具有正向调控作用，骨质疏松性骨折愈合组织中OPG表达减弱，是影响骨折愈合的重要原因。并且OPG/RANK/RANKL系统作为骨代谢的重要下游系统，可能是大多数细胞因子调控骨代谢的最终通路，Jude［8］等通过用小分子物质刺激OPG的表达，从而影响骨代谢的实验证明了这一观点。因此随着对该系统研究的深入，将为骨质疏松性骨折的治疗开辟广阔的前景。
参考文献：
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［8］Jude E,Onyia,Rachelle J，et al.Novel and selective small molecule stimulators osteoprotegerin expression inhibit bone resportion［J］.J Pharmac and Exp Ther,2004,309:369
(深圳市人民医院,广东 深圳 518020）
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