《生化危机5：惩罚》承接前作，爱丽丝（米拉·乔沃维奇饰）在救出被冷冻的同伴后，众人撤离之际遭到保护伞公司雇佣兵的疯狂追杀，队伍几乎全军覆没。T病毒使红皇后程序发生异变，保护伞公司借机重启全球清洗计划，将幸存者困于地下模拟实验场中。

爱丽丝被俘后醒来，发现自己身处由红皇后操控的虚拟现实训练场，场景从东京街头到莫斯科雪原不断切换，每一关都布满新型变异怪物与克隆战士。她在闯关中陆续与老友重聚，包括克莱尔、吉尔等熟悉面孔，并结识新的盟友，逐步识破实验场的运作规律。

随着真相揭开，爱丽丝发现保护伞公司正利用模拟环境测试生化武器的实战数据，而幕后黑手正是她昔日的宿敌。她带领同伴突破层层关卡，摧毁实验核心，最终与红皇后及幕后主使展开正面交锋。影片以高密度动作场面和多重反转收尾，为人类存亡留下悬念。