《少女爱上姐姐》改编自同名恋爱冒险游戏，讲述镝木财阀独生子宫小路瑞穗因祖父遗愿，被迫转入圣应女子学园就读。他长相清秀、成绩优异，却性格温和弱气，为避免身份暴露引发麻烦，在青梅竹马玛利亚等人的协助下穿上女装，以“宫小路瑞穗”之名开始女子学园生活。

入学后，瑞穗被安排进宿舍，与个性鲜明的室友和同学们相处。他既要应对课堂点名、更衣、体检等可能暴露性别的危机，又因温柔体贴、举止优雅，逐渐成为众人仰慕的“姐姐大人”。故事围绕校园日常展开，包含宿舍生活、社团活动、学园祭等情节，既有轻松搞笑桥段，也有角色间细腻的情感互动。

随着剧情推进，瑞穗与多位少女建立深厚羁绊，同时不断面对“是否坦白身份”的内心挣扎。作品以男扮女装为核心设定，融合校园、恋爱与喜剧元素，展现主角在隐瞒与真诚之间的成长，以及周围人物各自的心事与选择。